式中
A<[s]>为内标的峰值；
m<[r]>为加入对照品的量；
f<[1]>为维生素D的校正因子；
m<[s]>为加入内标物质的量；
A<[r1]>为维生素D的峰值；
A<[r2]>为前维生素D的峰值。
含量测定
取各该制剂项下制备的供试品溶液进行测定,按下列公式计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量。
mi＝(f<[1]>·A<[i1]>＋f<[2]>A<[i2]>)·m<[s]>／A<[s]>
式中
A<[i1]>为维生素D的峰值；
A<[i2]>为前维生素D的峰值；
m<[s]>为加入内标物质的量；
A<[s]>为内标的峰值。
第二法
精密称取供试品适量(相当于维生素D总量600单位以上，重量不超过2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇30ml、抗坏血酸0.2g与50％(g／g)氢氧化钾溶液3ml[若供试量为3g，则加50％(g／g)氢氧化钾溶液4ml]，置水浴上加热回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60～100ml分数次洗涤,洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次，第一次60ml,以后每次40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化,直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液A。
净化用色谱柱系统分离收集维生素D
精密量取上述供试品溶液A 500μl,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇－乙腈－水(50∶50∶2) 为流动相进行分离，检测波长为254nm，从计录仪上观察色谱图，要求维生素D与前维生素D为叠 峰，并能与维生素A及其他干扰含量测定的杂质分开；准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干,精密加入已知内标浓度的正己烷溶液适量(不少于2ml，并使每1ml中含维生素D为50～140单位,内标物质与维生素D的重量比约为4∶1)，密塞，超声处理助溶，即为供试品溶液B。
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