Key words gastric cardical cancer p15gene methyation MSP DNA
甲基化是哺乳动物最普遍的一种基因外调节方式，是Epigenetics（表遗传学或拟遗传学）上研究最深入的一种机制，现已确切证明DNA甲基化与肿瘤的发生发展密切相关。p15是近年来发现的一类CKI分子（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI细胞周期引擎分子的抑制剂）之一，能特异地与cylinD/CDK4或cylinD/CDK6结合并阻抑它们的活性，作为细胞生长负调节因子，控制细胞G 1 /S期的转移 ［1］ 。本文针对p15基因启动子区设计引物，对经过化学修饰的DNA进行PCR扩增，探讨p15甲基化与贲门癌变的关系。
1 材料与方法
1.1 材料 本研究所采用组织材料均来自河南贲门癌高发区林州市当地居民，包括76例贲门癌癌组织、相应癌旁组织以及远癌正常胃粘膜，所有标本参照组织病理学论断标准病理证实 ［2］ 。其中男53例，女23例，平均年龄56岁。所有患者术前均未接受化疗和放疗。
1.2 DNA的制备 每例分别取癌、癌旁3cm新鲜冰冻组织
以及远癌正常胃粘膜各10mg，置于研磨器中加入液氮研成细沫状态，DNA提取采用Gentra公司的Puregene TMDNAIsoˉlation Kit，操作按说明书进行。提取的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，所有样品均有DNA亮带。
1.3 甲基化特异性PCR（MSP） 在亚硫酸氢盐的作用下，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基反应转变成了尿嘧啶，但是5-甲基胞嘧啶不发生转变。因此，如果DNA原始甲基化情况不同，处理后DNA序列将不一样。经过化学修饰的DNA进行PCR扩增，甲基化特异引物可以扩增修饰前有甲基化的DNA，而非甲基化引物对这样的DNA不能扩增出条带。相反，非甲基化引物可以扩增修饰前没有甲基化的DNA，而甲基化对这样的DNA不能扩增出条带。根据上面的原理，就可以由引物判断原来DNA的甲基化状态。在实际操作中常常会有甲基化与非甲基化条带同时出现的情况，这是因为在异常甲基化的细胞中掺杂了正常的或炎性的没有甲基化的细胞，或者是肿瘤细胞中的一个等位基因发生了甲基化而另一个没有甲基化，称之为半甲基化状态（Hemi-methylation）。
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