1.3.1 DNA修饰 本实验采用Intergen公司的CpGenome TM DNAModification Kit对DNA进行甲基化修饰，操作步骤按说明书进行。
1.3.2 引物 PCR引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。引物参考文献 ［3］ ，上游引物在288碱基处，下游引物在458碱基处。甲基化上游引物为5′-GAT CGG TCG TTC GGTTATTG-3′，下游引物为5′-CTT ATT CTC CTC GCG CATTC-3′，扩增片段约为207bp;非甲基化上游引物为5′-GTT GTT TGG TTA TTG TAT GGG-3′，下游引物为5′-CCC TTA TTC TCC TCACAC AT-3′，扩增片段约为204bp。
1.3.3 PCR扩增 扩增反应总体积为25μl:10×Buffer（100mM Tris-HCl pH8.8，500mM KCl，0.8%Nonidet P40），25mMMgCl 2 （购自MBI Fermentas公司），2.5mMdNTP（each），5%DMSO，上下游引物各反10pmol，2UTaq DNA Polymerase（20mM Tris-HCl pH8.8，1mM DTT，0.1mM EDTA，100mM KCl，0.5%Nonidet P40，0.5%Tween20，50%Glycerol），100ng DNA。反应采用touchdown PCR:95℃预变性5min，95℃30s，65℃30s，72℃30s，之后每个循环递减0.5℃，共30个循环，72℃延伸10min。为了保证检测的可靠性，以经过SssI甲基转移酶处理过的胎盘DNA作为p15基因启动子甲基化的阳性对照 ［4］。以双蒸水代替模板作为阴性对照，扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳（50V，30min），EB染色，紫外灯下拍照。
2 结果
贲门癌及癌旁组织甲基化水平检测结果。72例癌组织中有13例甲基化阳性，占18.1%，基中半甲基化5例;癌旁组织中有4例甲基化阳性，占5.6%，基中半甲基化3例;20例正常胃粘膜组织均为非甲基化。
图1 MSP检测贲门癌及癌旁组织中p15基因甲基化状态1:DNA标准分子量DL20000;3、5、7:甲基化扩增产物，其中5为阳性对照;2、4、6、8:非甲基化扩增产物
3 讨论
yclin复合物结合，抑制它们的激活，属于直接“刹车”，决定了它们在防止细胞转化的细胞癌变方面起了不可替代的作用，“刹车”失灵，细胞生长必将失控，而p15基因编码的产物p15蛋白与CyclinD1竞争性结合CDK4/6抑制其活性，主要作用于晚G 1 期，因此p15能够使细胞周期在G1/S转换中 停滞，对细胞周期起负调控作用，故p15基因的失活可能与肿瘤的发生发展有关。
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