选健康成年杂种犬10只, 体重8.0～15.0 kg, 于第4气管环水平切断一侧喉返神经, 在手术显微镜下以9-0无创伤缝线作喉返神经端端缝合术, 术后3、6、12、18、24周后取材, 每时间亚组2只犬。
二、α-BT-HRP交联与N-AchR标记
以过碘酸盐氧化法将α-BT(Sigma，美国)与HRP(Sigma，美国)作交联, 再通过Sephadex G-100柱分离α-BT-HRP, 洗脱液分管收集, 合并峰管得α-BT-HRP交联物, 以免疫双扩散及二氨基联苯胺显色鉴定。 动物麻醉后分离暴露出双侧甲杓肌及环杓后肌, 分离出小束肌纤维, 以牙签棒维持其原来长度, 取肌纤维全长, 浸入含1×10-7 mol/L α-BT-HRP结合物的Tyroid溶液中, 置37℃吹氧培养3 h, 继之以二氨基联苯胺显色10 min。
三、N-AchR定位、电镜观察
显色后的肌纤维在立体解剖显微镜下可见到被标记的NMJ, 将肌纤维束分离成单根纤维, 以1%锇酸作后固定, 采用平板倒扣法, Epon 812包埋, 半薄切片后观察到显色的N-AchR, 再次定位、包埋, 超薄切片H-800透射电镜观察。以图像分析系统(华东理工大学自动化研究所)随机对每样本10个不同的NMJ所定微区N-AchR作定量分析。每亚组4样本所得结果取平均值, 与健侧比较获各亚组N-AchR的恢复率,以t检验作统计分析。
四、对照实验
1．抑制对照：以α-BT替代α-BT-HRP结合物, α-BT浓度也为1×10-7 mol/L, 其它操作步骤均同上述实验组。
2．HRP对照：除以含HRP的Tyroid溶液替代α-BT-HRP结合物外, 其它操作步骤均同上述实验组。
结果
一、α-BT-HRP交联及对照实验
结合物经琼脂糖免疫双扩散对马抗银环蛇毒素全血清呈明显的单一白色线条, 再与二氨基联苯胺反应后变成棕黄色线条。抑制对照试验仅显示单一白色线条； 以HRP代替α-BT-HRP, 显色反应呈阴性。表明α-BT-HRP结合物对N-AchR结合活性高、特异性强。
二、正常状态下N-AchR
图1 正常状态神经肌肉接头及AchR超微结构。突触后膜N-AchR免疫活性沉积物电子致密度高,基本连续。电镜×6 000
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