RT－PCR方法对检测乳腺癌干细胞富集血残存肿瘤细胞的价值

　　1.3　RT－PCR

　　cDNA第一链的合成（Boehringer Mannheim产品）：使用20μl体系，主要包括以下成分：反应缓冲液、10mmol/LdNTP、1μgtotalRNA(0.1μgm RNA)、50U RNase inhibitor、50UAMV反转录酶、1.6μgoligo(dT)₁₅引物。于42℃反应30分钟，99℃5分钟终止反应。PCR(TaKaRa产品）：建立100μl的反应体系，主要成分如下：反应缓冲液、10mmol/LdNTP、引物（上、下游引物终浓度均为0.2μmol/L,引物序列见附表）、2～3μlcDNA产物、5UTaqDNA聚合酶。95℃10分钟预变性，反应40个循环，每循环94℃、60℃、72℃各1分钟，最后一个循环72℃保温10分钟。

附表　RT－PCR扩增中使用的引物序列

　　1.4　琼脂糖凝胶电泳

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