2 材料和方法
2.1 材料
将大白鼠麻醉或断头后,立即摘去眼球,并保留视神经,其过程在2 min之内完成。
2.2 方法
2.2.1 取材与预固定 将摘出的眼球用0.1 M磷酸缓冲液(pH7.2~7.4)洗净表面的血液,立即浸入4%多聚甲醛—2.5%戊二醛混合固定液中,用4号针头沿赤道部将眼球打一小孔,将针头轻轻退出约1 mm,用空针缓缓推入预固定液,在预固定12 h后,沿赤道部将眼球割成二半,分别取出各种组织,组织切成1 mm3大小,继续固定2 h,然后用3%EDTA-Na2软化20 min。
2.2.2 清洗 0.1M磷酸缓冲液反复清洗5次,每次10~20 min,并浸泡过夜。
2.2.3 后固定 1%四氧化锇固定液固定2 h(4 ℃)。
2.2.4 脱水 用30%、50%、70%的丙酮各脱水5~10 min(4℃),90%的丙酮脱水10~15 min(室温),100%丙酮脱水40 min(换三次)。
2.2.5 浸透 用Epon812包埋液+丙酮(3∶1)浸泡45 min(35 ℃);纯Epon812包埋液浸泡2 h(45 ℃)。
2.2.6 包埋 将经以上步骤处理的样品,放置定向包埋模具中,方向应为保持所需眼组织的全层结构为准。加入新鲜的Epon812包埋液,使组织完全浸泡于包埋液中。
2.2.7 聚合 在45 ℃下聚合10 h,在60 ℃下聚合12 h。
2.2.8 修块、半薄切片、超薄切片、染色 按常规进行,H600-Ⅳ型透射电镜观察。
3 结果与结论
3.1 结果
用该方法制备的样品,包埋块硬度适当,无过硬过脆现象,在切片过程中,切片韧性较好,切片厚度可达500~600 nm,切片颜色为浅黄色,无散片现象,包埋液浸透良好。
超薄切片在电镜下观察,各种组织的超微结构清晰可见,如视网膜中的各层组织,角膜上皮组织,虹膜组织等。在视网膜色素上皮细胞中可见,细胞核、色素颗粒、线粒体。角膜上皮细胞中可见细胞核、核仁、粗面内质网、线粒体、微丝等,胞间可见桥粒。其超微结构保存良好(图1、2)。
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