微机化光度法细胞粘附的定量检测

图1　仪器结构图

　　Fig 1　The outline of the instrument structure

　　1.thermostat water bath; 2.pump; 3.reservior; 4.sampling valve; 5.light receptor; 6.objective; 7.parallel plate flow chamber; 8.light filter(293nm); 9.light source; 10.computer

　　2.2　实验试剂

　　2.2.1　缓冲液1(mM)　NaCl, 137;KCl, 4;CaCl₂,1.8; Na₂HPO₄, 0.8;HEPES,8.4; pH,7.4; 渗透压，300±10 mOs mol/kg。

　　2.2.2　缓冲液2　缓冲液1中加0.1%的无水葡萄糖，10 Pa、10 min高压灭菌。

　　2.2.3　缓冲液3　缓冲液2中加0.1%牛血清白蛋白，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。

　　2.2.4　细胞培养液　DMEM细胞培养液(GIBCO)中加10%的胎牛血清(GIBCO)，10%新生小牛血清(中科院细胞所)，L-谷氨酰胺0.9 g/L，Hapes 20 mmol/L，青霉素100 u/ml，链霉素100 mg/ml。0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存。

　　2.3　细胞制备

　　2.3.1　红细胞悬液的制备　取新鲜健康人全血2～3 ml，用缓冲液2洗涤3次(每次1000 g离心5 min)。取压紧红细胞，制成1%的红细胞悬液备用。

　　2.3.2　单层红细胞的制备　通过加样开关，加入红细胞悬液至流动腔灌满，静置15 min后，用1.17 Pa的切应力冲洗1 min去除未粘附的细胞，流动腔中剩余红细胞即为单层红细胞。

　　2.3.3　血管内皮细胞的培养　参照Bowman等的方法^［4］并加以改进，分离、培养出Wistar大鼠的脑血管内皮细胞，经Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定阳性。将3～5代的内皮细胞培养至5 mm×10 mm的盖玻片上，待细胞基本融合时备用。

　　2.4　测量步骤

　　2.4.1　单层红细胞平均密度的计算方法　在25×10的放大倍数下，计数视野中每个方格(0.03 mm×0.03 mm)中的红细胞数，取10次平均数。换算成单位面积的细胞数即为单层红细胞的平均密度。

　　2.5　数据处理

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