陈坚 张晓琴 傅继梁
摘 要 目的: 获得HDAC1 的cDNA及构建酵母双杂合系统中的靶基因。方法: 利用RT-PCR方法，从人Jurkat 细胞中扩增出一约1.45kb的DNA片段，作全自动测序,重组入pLexA载体，构建成pLexA-HDAC1, 并用醋酸锂法转化酵母菌EGY48, 在选择性培养基上观察pLexA-HDAC1 在EGY48中的表达情况。结果: 获得的1.45kb的DNA编码的氨基酸序列与文献报道的HDAC1一致，转化的酵母菌在选择性培养基SD/Gal/Raf/-Ura/-His/上培养3d后, 长出约1mm大小的白色菌落。结论：获得了HDAC1的cDNA，pLexA-HDAC1对EGY48没有毒性作用，也没有自身激活LacZ功能，可作为酵母双杂合系统中的靶基因。
关键词：组蛋白脱乙酰化酶 酵母双杂交系统
组蛋白的乙酰化和脱乙酰化可以修饰染色质的结构，从而调节基因的转录。HDAC1 是1996年由美国哈佛大学的Taunton等［1］发现的第一个哺乳动物的组蛋白脱乙酰化酶。其蛋白质含有482个氨基酸，相对分子质量约5.5万，与酵母转录因子Rpd3p有高度同源性，推测其可能是哺乳动物基因转录的关键调节子。1997年有数家实验室［2～5］同时报道了HDAC1可介导位点特异的DNA结合的转录抑制子（例如Mad家族、非配体化的核受体等)的作用，他们发现转录抑制子结合转录共抑制子mSin3A或mSin3B，后者再结合HDAC1形成一个复合物。但HDAC1是如何具体调节基因转录？是否还介导其他转录因子的作用？仍有待研究。本研究拟利用RT-PCR方法从人Jurkat 细胞中克隆HDAC1的cDNA，重组入酵母双杂合系统的靶基因载体pLexA，构建成pLexA-HDAC1，转化含(p8op-LacZ)质粒的酵母菌EGY48，测试其对酵母细胞有否毒性及能否自身激活报告基因。从而为进一步寻找与HDAC1相互作用的可能的其他因子打下基础。
1 材料和方法
1.1 材料 质粒pLexA，pLexA-Pos和含(p8op-LacZ)质粒的酵母菌株EGY48购自Clontech公司，pGEMeasy购自Promega公司,大肠杆菌DH10B为本室保存。 人急性T细胞白血病细胞Jurkat细胞购自中科院上海细胞所。培养液是含10%小牛血清的1640。总RNA提取、逆转录合成cDNA第一链试剂盒为Gibco公司产品。全自动测序试剂盒为PE 公司产品。内切酶和T4 DNA连接酶购自 Boehringer Mannheim公司。其他生化试剂均为国产分析纯。
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