2.根据已报道的COL4A5基因序列［10］，选取与外显子相邻的内含子序列设计引物（表1），迄今所扩增的序列为COL4A5基因的第20～51外显子（自5′端记数），引物由Genosys Biotechnologies，Inc.及Cybersyn公司合成。
3.PCR反应：在50 μl反应体积中，加入0.4～0.8 μg基因组DNA为模板，引物为1 μmol/L,dNTPs各为400 μmol/L，Taq酶（Promega公司）1～2.5 U。前5个循环为94℃变性1分钟，退火温度分别为68℃、66℃、64℃、62℃、60℃，时间30秒，延伸温度72℃、45秒。随后30个循环为：94℃、1分钟，退火温度见表1，时间30秒，延伸72℃，45秒（PCR热循环仪，Perkin-Elmer公司）。PCR完成后作1.6%～2%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。
4.单链构象多态性（SSCP）分析：以含5%～10%甘油的10%聚丙烯酰胺凝胶制备20 cm×20 cm×0.1 cm胶板。取3 μl PCR产物，与甲酰胺上样液7 μl混合，96℃或100℃变性5～10分钟，迅速置入冰浴后上样，于4℃，120～160 V恒压电泳12～16小时。电泳完成后作硝酸银染色。
5.PCR产物直接测序：对SSCP分析出现单链DNA迁移率异常者，将PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后进行直接测序（北京医科大学肿瘤防治研究所及Cybersyn公司）。
结果
一、琼脂糖凝胶电泳结果
患者及正常对照的各外显子PCR反应产物均为单一区带，其大小与已知序列相一致。各PCR产物长度见表1。
二、SSCP及DNA测序结果
1.患者8第20外显子PCR产物的单链DNA迁移率与对照及其他患者有差异，测序证明为COL4A5基因的第1517C及1518C碱基缺失，导致移码突变，并使终止密码子TAG于1542位提前出现，α 5链长度由正常的1 685个氨基酸残基截短为439个氨基酸残基（图1）。
*表示患者8缺失的碱基图1 患者8COL4A5基因第20外显子PCR产物直接测序结果
将患者8及其父母的第20、39及46外显子的PCR产物同时作SSCP分析，其父仅有正常迁移带，其母兼有正常及异常迁移带（图2）。
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