用16SrRNA探针定量测定普氏立克次体在细胞内的繁殖量

　 来源：120online    　 日期：2007-05-16

　　【 摘要 】　目的　以普氏立克次体为研究对象，建立一种定量测定胞内微生物繁殖的方法。方法 从立克次体感染细胞提取总RNA为样品或用硫氰酸胍裂解感染细胞，以裂解物为样品，用³²P标记的16S rRNA特异探针做RNA酶保护分析。 根据探针分子结合数，计算出检测到的靶序列分子数，反映胞内微生物的繁殖量。　结果　从0.5μl直接裂解物可检测到3.94×10⁴个16S rRNA分子；从6pg的总RNA中可检测到5.82×10⁴个16S rRNA分子。用本法试测立克次体在宿主细胞内的生长曲线，只表现出迟缓期及对数生长期，而无稳定期及衰退期。　结论　用特异性探针通过RNA酶保护分析法可以定量测定胞内微生物在宿主细胞内的繁殖量。由本法测定到的普氏立克次体生长曲线表明难以沿用细菌的生长曲线来描述胞内微生物在宿主细胞内的生长过程。

　　Quantitative assay of Rickettsia prowazekii growth in host cells by using 16S rRNA probes　HU Fuquan, JIN Xiaolin, LIU Qifu, et al. Department of Microbiology, The Third Military Medical University, Chongqing 400038

　　【 Subject words 】　Rickettsia prowazekii　　RNase protection assay　　RNA probes

　　立克次体等胞内生长微生物不能在固体培基上生长形成克隆，难以用类似活菌计数这样的方法来做定量测定。显微镜下直接计数因其个体微小而难以进行。若欲分离纯化胞内寄生物，再用分光光度法测定，则面临分离操作难度大、分离过程中难免的样品丢失和污染蛋白影响定量准确等问题。空斑测定可视为一种克隆计数法，但需6～8天才能得到结果^〔1，2〕，且有些胞内寄生物生长后无明显细胞病变而不形成空斑，故胞内生长微生物的定量测定一直是一个问题。我们用普氏立克次体16S rRNA特异性探针作RNA酶保护分析建立了定量测定立克次体胞内繁殖量的方法。

　　材料与方法

　　2.细胞裂解物的制备：取培养细胞(感染与未感染)，去除培养上清，每个平皿(100mm)加入2ml细胞裂解液(含5mol/L硫氰酸胍，Sigma公司产品),用吸管吹吸使细胞裂解。裂解物直接用于测定。

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