3.细胞总RNA提取：取上述平行培养的细胞，去培养上清，每个平皿中加入0.5ml 0.3mol/L葡萄糖溶液及0.5ml 2％SDS溶液 (两者均溶于pH4.5的10mmol/L醋酸钠缓冲液中)，收集溶解细胞，置水浴中5分钟，加1ml预热至70℃的水饱和酚，再置70℃ 3分钟，12 000r/min离心10分钟。收集上清，重复上述抽提步骤，共三次。最后用0.3mol/L NaCl及2.5倍体积的冰无水乙醇沉淀核酸，再混悬于无RNA酶双蒸水中，-80℃保存备用。
4. 16S rRNA探针的制备：培养HW40细菌，用Wizard质粒提取试剂盒(Promega公司产品)，按操作说明提取质粒pHW40。该质粒中含有立克次体16S rRNA基因中的525个碱基序列〔4，5〕 。用EcoRⅤ使质粒线性化后作为模板，用试管内转录法生成探针： 取10×转录缓冲液2μl， 0.2mol/L DTT 1μl，rRNasin 20U，10mmol/L的ATP、GTP及CTP各1μl，0.1mmol/L UTP 2.4μl，32P-UTP 5μl(370kBq/μl)，线性化模板DNA 1μl(1μg)，T7 RNA聚合酶20U, 最后加水至20μl总体积。在25℃孵育60分钟后加入DNase 2U，孵育37℃ 15分钟以降解模板DNA。反应毕，用酚/氯仿法纯化探针。最后将探针混悬于200μl无RNA酶双蒸水中,并通过三氯醋酸沉淀法测定32P-UTP的掺入率(Ri)：
注：CPM即放射性强度
5. RNA酶保护分析〔6-9〕：将不同量的样品分别与5μl标记探针混合，加水至100μl，用冰乙醇沉淀，再将沉淀混悬于30μl杂交缓冲液(40mmol/L pipes，1mmol/L EDTA，0.4mol/L NaCl，10％甲酰胺) 中，42℃杂交反应过夜。再向反应管中加入30μl RNase酶解液(300mmol/L NaCl，pH7.4的10mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，RNase A 10μg/ml，RNase T1为2U/ml)，37℃孵育60分钟，在此期间，未形成杂交体的RNA分子(包括被检测序列和探针) 被RNase裂解。随后加30％TCA沉淀杂交分子。用过滤法收集沉淀物，用30％TCA及冰乙醇各洗膜3次，最后用液闪计数仪测定沉淀物中的CPM。
结 果
1.标记探针分子数的计算：探针与所检测的靶分子的结合是1∶1，通过被结合的探针分子数即可知测到的靶分子数。下面是探针溶液中探针分子数的计算。
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