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用16SrRNA探针定量测定普氏立克次体在细胞内的繁殖量

  来源:120online      日期:2007-05-16
中华微生物学和免疫学杂志1999年第2期第19卷立克次氏体作者:胡福泉 金晓琳 刘启富 俞树荣单位:400038重庆,第三军医大学微生物学教研室关键词:立克次体;普氏;核糖核酸酶类;RNA探针...

  (1) 标记探针时投入的32P-UTP分子数: 标记时用了5μl(15.4μmmol/L)的32P-UTP,故其中含77pmol,每pmol含有66.023×1011分子,故有:

  6.03×1011×77=4.64×1013(分子) (Ⅰ)

  (2)标记探针时投入的UTP分子数:标记时用了2.4μl (0.1mmol/L) UTP,其中含有240pmol,故有:

  6.023×1011×240=14.45×1013(分子) (Ⅱ)

  (3)标记UTP占总UTP的百分数:由(Ⅰ)、(Ⅱ)式可知:

  4.64×1013/(4.64×1013+14.45×1013)=24.3%   (Ⅲ)

  (4)总探针中结合进去的32P-UTP分子数为:

  4.64×1013×Ri  (Ri为掺入率,实测得到)  (Ⅳ)

  (5)每个探针分子中结合进去的32P-UTP分子数:根据模板碱基序列,可知在本系统中, 每个探针分子共有136个UTP,其中32P-UTP 应占24.3%,故:

  136×24.3%=33(个) (Ⅴ)

  (6)探针制备中生成的探针分子总数:用掺入探针的总32P-UTP数〔见(4)〕除以每个探针中的32P-UTP数〔见(5)〕即得此值:



  (7)每μl探针中的探针分子数:由于总探针混悬在200μl中,故有:



  在(Ⅶ)式中,只有Ri是未知数,每次探针标记后,根据实测的Ri,就可知道每μl探针溶液中含有多少探针分子数。取1μl探针溶液测定其放射性强度。根据下式:



  我们就可计算出每个CPM值代表了多少探针分子数。

  表1 总RNA样品的实测结果

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