三、对细胞内钙颗粒进行定量分析〔4,5〕
细胞内钙颗粒的数密度(NV)为单位体积(1μm3)内该颗粒的数量,可按公式Nv=NA·D计算〔6〕。NA为颗粒的面数密度,即单位截面积(A)中钙颗粒数(n),NA=(n)/(A),D为颗粒的平均直径。式中n, A及同一截面内各颗粒的直径d1, d2, …, dn都可用图象分析仪测得。体密度
vV为单位体积细胞质内的颗粒体积VV=(n)/(i=1Axi)/(n)/(i=1Ari)(Axi为第i张照片上钙颗粒的截面面积,Ari为第i张照片上参照系的截面面积)。
二维图象上的面积通过图象处理仪很容易测得。收集资料时,在H-600透射电镜下观察,放大倍数6 000倍左右。动物共分三组:正常组、对照组和保护组。其中对照组又分为DHCA结束、再灌60分钟和术后8小时,保护组分为再灌60分钟和术后8小时.。每组约拍6张照片,共获
40张左右。电镜照片通过摄像机输入显示屏。我们通过Ca2+细胞化学技术能使细胞内Ca2+原位沉淀,在电镜下可见到高电子密度的Ca2+颗粒,图象处理仪很容易分辨。通过二值图分割,留下感兴趣的钙离子颗粒,由德国产IBAS图象处理系统进行分析计算,从而获得颗粒直径、颗粒平均面积、颗粒的最大径和最小径等参数。再通过计算求得数密度和体密度,结果见表1,并用t检验求出各组t值,得出各组间的参数差异程度。
结 果
一、细胞的超微结构改变
在透射电镜下可见正常组神经细胞内钙颗粒分布较少,细胞器结构正常。见图1。对照组在经DHCA 2小时后,神经细胞破坏明显,线粒体肿胀,嵴断裂,胞质与线粒体内均可见到较多黑色圆形钙颗粒,大小不等、分布不均,呈单个沉着,见图2。DHCA2小时再灌注60分钟,致密颗粒呈簇状聚积于线粒体,粗面内质网与高尔基复合体中,细胞器破坏明显,见图3。特别是术后8小时,线粒体空泡变性呈“气球样”变化,内有簇状钙沉着,部分线粒体膜模糊不清、结构消失,见图4。而脑保护组经用FDP后细胞损伤明显减轻,保护组DHCA2小时后再灌
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