放线共生放线杆菌（Actinobacillus actinomy-cetemcomitans, Aa）是重要的可疑牙周致病菌，近年来一直受到牙周病学者的广泛关注。现已发现Aa分泌白细胞毒素,并认为它是Aa的主要致病因子。Aa不同菌株分泌白细胞毒素的水平不同，最早报道与血清型有关, 尤其是b型，b型多存在于青少年牙周炎个体［1］。一般认为b型更易分泌白细胞毒素，具有更强的致病性。我们也对来自不同牙周状况的Aa临床分离菌株进行了血清分型，却发现包括青少年牙周炎在内检出的大部分是c型。随着分子生物学技术的发展，Aa白细胞毒素基因已克隆并测序。有研究报道 Aa白细胞毒素水平的差异与它们的基因结构有关［2］ ，高毒株JP2启动子与低毒株652启动子相比缺少了530 bp的基因片段。根据这一特点设计合适的引物应用PCR技术可区别白细胞毒素高毒株与低毒株［3］。我们应用这一技术检测分离、保存的不同血清型Aa临床菌株的白细胞毒素水平，以期进一步了解Aa及其白细胞毒素与牙周病的关系。
材料及方法
1．菌株：①参考菌株：放线共生放线杆菌JP2（血清型b）， ATCC43717（血清型a）， ATCC43718（血清型b）， ATCC43719（血清型c），ATCC29523（血清型a），ATCC24523（血清型a），侵蚀埃肯菌ATCC23834，中间普氏菌ATCC25261，牙龈朴啉单孢菌P381, 14-3-2, ATCC35406, ATCC33547, 47-1，具核梭杆菌ATCC25586，亲缘链球菌ATCC22607，粘性放线菌ATCC19246，变型链球菌（血清型c）。以上菌株来源于美国宾西法尼亚大学和日本鹤见大学。嗜沫嗜血杆菌654（华西医科大学）。②临床菌株：68株Aa分别来自13例龈炎，8例青少年牙周炎，3例成年人牙周炎及1名牙周健康者, 共计25例，其中b型17株，c型42株，a型（可能包括d，e型）9株［4］。
2．DNA模板：所有菌株菌体放入微量离心管，生理盐水洗2遍，加入100 μl TE-Triton X-100裂解液（10 mmol/L Tris HCl 1 mmol/L EDTA 1% Triton X-100）， 100℃ 10 min，取上清加入饱和NaCl，剧烈震荡15 s，8 000 r/min，离心10 min，取上清加入无水乙醇，-20℃ 1 h 12 000 r/min，离心20 min，弃上清，70% 乙醇洗2遍，DNA加入TE液溶解，-20℃保存备用。
3．引物：两条合成引物核苷酸序列分别为5＇-TCCATATTAAATCT-CCTTGT-3＇和-5＇-AACCTGATAACA-GTATT-3＇，扩增片段为白细胞毒素启动子+5到-487，总长度高毒株JP2为492 bp，低毒株ATCC43717为1 022 bp。
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