放线共生放线杆菌白细胞毒素水平检测

　　4．PCR：总反应体积为20 μl，重蒸水11 μl， dNTP（含4种脱氧核糖核苷酸各2.5 mmol/L）2 μl，10×缓冲液2 μl，（Mg离子浓度1.6 mmol/L），引物4 μl（20 pmol），模板l μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl（含1U）混匀后加20 μl石蜡油覆盖混合液，放入DNA扩增仪（PCR-90AR）。94℃预变性5 min; 然后94℃变性40 s，48℃变性40 s，72℃延伸3 min，共计35个循环; 最后延伸9 min。每批反应设置阳性对照为JP2，ATCC43717，阴性对照为654及不加DNA模板的空白对照。

　　5．扩增产物检测：1% 琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪（UVP ZmageStore 7500）观察扩增片段。相对分子质量大小参照物为ΦX174/HaeⅢ和PBR322/MSPI。

　　结果

　　以JP2及其他5株Aa参考菌株DNA为模板，分别扩增出相对分子质量大小不同的DNA片段，与DNA相对分子质量标准物对比，片段大小分别为492 bp和1 022 bp，与预计大小一致，12株口腔常见异种菌参考菌株DNA模板均未出现扩增产物，不加模板的空白对照无扩增产物出现（图1, 2），68株临床菌株DNA模板均扩增出1 022 bp片段（图3）。

　　讨论

　　Aa白细胞毒素一直是牙周细菌学研究的一个热点。白细胞毒素特异地破坏人类和灵长类的多形核白细胞和巨噬细胞，抑制和破坏宿主的免疫防御机制，但对其他动物的白细胞及人类的其他细胞无杀伤作用。Aa白细胞毒素与溶血巴斯德菌的白细胞毒素及大肠杆菌的α-溶血素，在基因结构上存在广泛的同源序列，目前认为是Aa最重要的潜在致病因子。

1：ΦX 174/Hae III;　2：JP2；　3：ATCC 43717；　4：654；5：空白对照

1　Aa国际参考菌株PCR扩增产物