牙周疾病是由细菌感染引起的，牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis, P.g)是其重要的致病菌之一。P.g可产生多种毒力因子，包括纤毛素(fimbrilin)和各种蛋白酶(protease)［1］，但是其分离鉴定比较困难，临床常用方法的检测结果尚不能令人满意。近年来，聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)为在基因水平上检测P.g提供了有力的手段。本项研究运用PCR技术，检测了临床的92个样本并与培养法(culture method )和间接免疫荧光法(indirect immnofluorescence, IF)相比较，旨在探求一种适合于临床应用的、快速敏感的牙周菌斑检测方法。
材料和方法
1.引物合成 :根据Watanabe和Frommel等［2］报道的方法，由北京医科大学附属人民医院中心实验室合成。引物1为P1-5'ATAATGGAGAACAGC-AGGAA3'，引物2为P2-5'TCTTGCCAACCAGTTCC-ATTGC3',扩增片段为131 bp。
2.试剂: TaqDNA聚合酶,5×扩增缓冲液, 4×dNTP(脱氧核苷酸), PBR322DNA /Bst NI,P.g菌体抗体,荧光抗体, CDC非选择培养基(氯化血红素5 g/L,维生素K 10 g/L,脱纤维羊血5%),0.01 mol/L磷酸盐缓冲液。
3.病例选择:88个龈下菌斑标本取自北京口腔医院35名门诊成人牙周炎(adult periodontitis,AP)和龈炎(gingivitis)患者,年龄20～60岁。4个龈下菌斑标本来自门诊 1例青少年牙周炎(juvenile periodontitis,JP)患者。本组病例均无全身系统性疾病,半年内无抗生素治疗史。研究对象的一般情况见表1。
表1 研究对象一般情况
4.标本收集：对每名受试者选 1～3个牙周袋或龈袋为取标本点。用标准小环法收集标本，参照杨圣辉等［3］的检测方法。将取出的标本稀释至1 ml,再等分为3份,分别以免疫荧光法、培养法和PCR扩增进行检测。
5. 培养法:标本用震荡器混匀30 s,以生理盐水10倍系列稀释,选择稀释度为10-3的浓度接种于CDC固体培养基上,常规厌氧培养5 d后,检查细菌生长情况。初步做生化实验鉴定,不分解糖的为卟啉菌属(porphyromonasa)或普氏菌属(prevotella)，再做直接血凝试验及间接免疫反应。
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