6.间接免疫荧光法:采用杨圣辉等［3］报道的检测方法。
7.PCR法:
(1)细菌DNA的提取:将混悬于装有0.1 ml生理盐水的 Ep管中的临床样本 ,在旋涡混合器上震荡混匀 ,弃上清 ,加入25 μl细菌裂解液(50 mmol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH7.6, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.1 μg/L明胶, 0.45% NP-40 , 0.45 % Tween 20)及蛋白酶K 10 μg/L,混匀,置于55 ℃水浴2 h,100 ℃10 min,0 ℃10 min,10 000 rpm离心 10 min ,保留上清,待用。
(2)PCR扩增 :总反应体积为25 μl,5×Buffer缓冲液5 μl,2.5 mmol/L dNTP(含4种脱氧核苷酸)2.0 μl, TaqDNA聚合酶1 μl(0.5 U/μl)、引物(P1, P2)各12.5 pmol/μl , 细菌DNA提取液1 μl,加三蒸水至25 μl,混匀后加10 μl石蜡油。反应按预变性 94℃4 min,变性 94℃ 45 s,退火 56℃45 s,延伸至72℃ 60 s, 经30个循环后,延伸72 ℃ 5 min。
(3)检测扩增产物 :取扩增产物10 μl,2.0%琼脂糖(0.5 mgEB/L)凝胶电泳,以PBR322DNA/BSTNT为参照物,紫外灯下观察［4］。如扩增产物与对照组产生相同的特异性扩增带,则表明为PCR阳性标本，否则为阴性标本，见图1。设置对照组:①ATCC33277为模板作阳性对照; ②加除ATCC33277模板以外的PCR系统所有其他成分;③加ATCC33277模板,但不加引物; ④分别以92样本DNA为模板。
1 PCR扩增P.g特异性片段临床标本凝胶电泳图谱
结果
1.培养法、间接免疫荧光法及PCR阳性检出率结果：见表2。可看出PCR检出率最高。
表2 培养法、IF法及PCR法P.g阳性检出率(%)
表3 PCR和培养法分析阳性结果比较
PCR与间接免疫荧光法的比较结果见表4。经卡方检验, PCR法显著高于荧光法，P＜0.001。相关性检验表明，两种方法呈显著相关, P＜0.01。
