二、实验方法
————————
（一）DNA提取：将实验菌株接种于PDA，27℃培养2周，收集菌丝体约0.1g，用氯化苄法提取DNA[3]，并在质量分数为0.8％琼脂糖凝胶上检测DNA的量和浓度。
（二）PCR扩增：应用引物ITS3和ITS4[4]（华美公司合成）对ITSⅡ进行扩增。50μL反应体系含10mmolTris·HCl，1.5mmolMgCl,800μmol4dNTP,0.4μmolITS3,0.4μmolITS4TaqDNA聚合酶1U。反应条件：94℃变性1min，52℃退火50s,72℃延伸1min20s，35个循环。
（三）酶切：将PCR产物分别加入MspⅠ、BsuRⅠ、RsaⅠ和HinFⅠ37℃孵育3h，纯化后用质量分数为2％琼脂糖凝胶分离，以puc19DNA经MspⅠ彻底水解后的产物(MBI公司生产)作为分子量标记。紫外灯下照相，并在UV凝胶成象分析系统中成象。
（四）统计分析：应用单匹配系数(Singlematchingcoefficient，SM)表示物种的亲缘关系，计算方法为：SM=a/(a＋b),式中a为两菌共有的“1”和“0”的条带数,“b”为非共有的条带数。菌株间的相似性为：SM×％。将每个菌的“1”和“0”输入,经Ntsys软件分析得到单匹配系数矩阵图，用该软件的UPGMA聚类分析法生成表示菌株间亲缘关系的树状图。
图1甄氏外瓶霉ITSⅡ区酶切带型图
结果
各菌株ITS间区扩增片段约为330bp，4种内切酶酶切后带型见表1。HinFI只对北京大学真菌和真菌病研究中心(BMU)00195（E.jeanselme ivar.lecanii－corni）有一个识别位点，MapⅠ及RsaⅠ对多数菌株均具有一个以上的切点,BsuRⅠ则只对半数以上菌株的ITS区有识别位点（图1）。
表1甄氏外瓶霉ITSⅡ间区酶切带型表
1～17分别为：0001、00011、00003、00007、00006、00004、00002、00009、00005、00012、00014、00010、00195、00480、00282、00481、00457
上一页 1 [2] 3 4 下一页
