新生隐球菌产黑素野生株和白化突变株的比较研究

　 来源：120online    　 日期：2007-05-07

　　新生隐球菌是一重要条件致病菌，其黑素对毒力的影响已经得到广泛的证实，而酚氧化酶是催化产生黑素的酶类，CNLAC1是编码新生隐球菌酚氧化酶的结构基因，Willimson等分离纯化了该酶^[1]，并据其N末端氨基酸序列克隆了编码其合成的cDNA序列和染色体基因^[2]；自然界中存在野生株和天然突变株，本研究应用PCR技术检测天然变异株突变情况，旨在进行野生产黑素株与白化突变株的比较研究。

　　一、材料和方法

　　(一)研究对象：128株隐球菌取自第二军医大学附属长征医院皮肤科真菌病研究室，并用多巴胺及咖啡酸培养基筛选出1株不产黑素的突变株CCCC10148，同时取1株野生CCCC10297菌株（产黑素株）。

　　(二)多巴胺培养基(CT)参考文献^[3]，由两部分组成：①多巴0.2g/L，5－氨基水杨酸0.5g/L，3,4－二氨基苯甲酸1.0g/L，加入天冬酰氨1.0g，谷氨酰胺1.0g，甘氨酸1.0g，用1mol/LK2HPO4调pH至5.5，用0.45μm滤膜滤过除菌。②K₂HPO44.0g，MgSO₄7H₂O2.5g，硫胺素10mg，生物素20μg，葡萄糖0.5～5.0g，琼脂25g溶于800mL去离子水，pH调至5.5，高压灭菌15min。咖啡酸玉米吐温培养基为咖啡酸0.3g，吐温8020mL，米粉10g，琼脂20g，定容至1000mL。

　　(三)PCR引物：参照新生隐球菌酚氧化酶结构基因CNLAC1设计4对引物，分别由中国科学院上海生化所及Takara公司合成，各用于扩增野生株及突变株CNLAC1片段。引物序列、位点分布如下：正向1：5′－AGACTTCTGCTTGGAGTGATCTA

　　GCGGG3′(44～71bp),反向1：5′－GCCA

　　ATGATTCTTCCAACCCGAGCG－3′(825～849bp)；正向2：5′－TTGTTTCCAGCGTCC

　　ATAATACTCTATGC－3′(36～64bp)，反向2：5′－GCAATGTTCTTTCTTACAGTCAGTG

　　TTGG－3′(1131～1159bp);正向3：5′－AAGAAAGAACATTGCTCCTCCACAAGG

　　－3′(0.1145～1171bp),反向3：5′－GAAGGTATTACCAAGAACATTCACAAAGG

　　C－3′(1887～1916bp)；正向4：5′－CGTAGACCACGAGACAGTCTTAGTGC－3′(1715～1740bp)，反向4：5′－AATGATT

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