图2 PCR检测野生株与突变株的酚氧化酶结构基因
图3PCR检测野生株与突变株的酚氧化酶
结构基因(引物4)
由4对引物分别对新生隐球菌野生株和白化突变株进行DNA扩增，检测结果发现，第1～3对引物的扩增带未见明显异常，2％琼脂糖凝胶电泳及3.5％PAGE结果一致（图1,2，第2对引物扩增包含了第1对引物扩增范围）。由第4对引物扩增出的酚氧化酶结构基因扩增带在株与株之间出现了明显的差异（1715bp～2617bp），产黑野生株如预期结果扩增出约900bp的条带，而白化突变株则出现约450bp的条带，重复8次结果完全一致，条带细亮特异，与Marker对照缺失约450bp（图3）。
三、讨论
新生隐球菌多糖荚膜和黑素的产生在其毒力中的重要性已得到证实。而新生隐球菌黑素的毒力作用主要与它保护酵母细胞抵抗游离氧和氮氧化剂，清除吞噬细胞内产生的抗微生物氧化物有关，它可以保护酵母细胞免受宿主效应细胞产生氧化物的破坏，并抵抗紫外线的抗真菌效应和降低对两性霉素B的敏感性。天然突变株不产生黑素的分子研究为人们诊断和治疗提供可能的靶目标，目前对酚氧化酶结构基因CNLAC1的进一步研究，国内外刚刚起步，本研究将第二军医大学附属长征医院皮肤科真菌病研究室保藏的128株隐球菌，用多巴胺及咖啡酸培养基筛选出不产黑素的突变株，根据Willimson克隆编码酚氧化酶合成的cDNA序列，设计了4对引物，分别用PCR技术对野生产黑素株及不产黑素的变异株进行扩增，发现白化突变株与野生产黑素株酚氧化酶结构基因存在明显差异（1715bp～2617bp）。
国家自然科学基金资助项目(39870658)
参考文献
［1］ Chartier FL,Keer JT,Sutcliffe MJ,et al. Construction of a mouse yeast artificial chromosome library in a recombination deficient strain of yeast.Nat Genet,1992,1:132－ 138.
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