材料和方法
1.研究对象:病例组:30例经门诊诊断的多形红斑患者,均为汉族,彼此间无血缘关系。男12例,女18例,年龄11～70岁。所有多形红斑患者排除药物因素,而且具有靶形红斑。单纯疱疹病毒引起者1例,细菌引起者5例,特发性多形红斑16例,复发性多形红斑8例。30例多形红斑患者同时检测了Ⅰ类抗原、Ⅱ类基因。对照组:Ⅰ类抗原:选择无血缘关系的汉族健康人100例,年龄15～58岁。男57例,女43例。Ⅱ类基因:选择无血缘关系的汉族健康人104例,年龄17～50岁。男50例,女54例。
2.实验方法:Ⅰ类抗原的检测:采用国际通用的NIH标准微量淋巴细胞毒试验方法[2,3]:外周血淋巴细胞分离。HLA－AB血清板每孔加1μL淋巴细胞悬液,22℃～24℃孵育30min。每孔加5％伊红染色5min后用37％中性甲醛固定。室温下静置60min后,在倒置显微镜下读数。本实验所用HLA－AB血清板由上海市血液中心HLA血清库提供。HLA－A位点包括HLA－A1、A2、A3、A9、A10、A11、A28、A29、A30、A30＋31、A3311个特异性,HLA－B位点包括HLA－B5、B51(5)、B7、B8、B12、B13、B15、B16、B17、B57(17)、B22、B27、B35、B39、B40、B44、B46共17个特异性。Ⅱ类基因的检测:采用聚合酶链式反应－序列特异性引物技术(PCR－SSP)。快速盐析法提取DNA。PCR反应体系为25μL体积中含有模板DNA100ng、10×缓冲液2.5μL、2.5mmol/LdNTP2.5μL、25mmol/LMgCl21.5μL。双蒸水滴加至25μL。每条引物0.25μmol/L。循环参数：94℃预变性4min后,94℃1min,65℃1min,72℃1min,计35个循环,后延伸72℃2min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外线灯下观察结果并照相。本实验所用22种引物由美国Florida大学提供。引物内部指控带为400bp,我们所检测的基因都在300bp以下。内部指控带除作为标准参照物外,尚有质量控制作用,体现各反应体系浓度是否正常。Taq酶、dNTP、10×缓冲液由Promega公司生产。
表1 多形红斑患者与正常人HLA－A，B基因频率比较(P＜0.05者)
结果
讨论
参考文献
［1］Ozawa A,Ohkidom,Tsuji K. Some recent advances in HLA and skin disease. J Am Acad Dermatol, 1981,4:205－ 230.
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