二、试剂与设备
玻璃珠为B.BraunMelsungenAG产品,TaqDNA聚合酶系北京大学免疫学教研室产品，dNTPs为SABC产品。高速振荡器根据旋涡混合器(QL－901型，江苏海门其林医用仪器厂)改装，在座托上加双层海绵后再压以重物，旁边设支架支撑以保持振荡时平衡。
三、菌种的培养和收集[3]
酵母菌在沙堡培养基培养24h后，取单个菌落(直径2mm)接种于5mLYPD液基中，念珠菌属30℃,350r/min下振荡培养24h，隐球菌属27℃,350r/min下振荡培养48h。2000×g离心10min集菌，以生理盐水洗涤1次。曲霉和青霉在PDA培养基30℃培养24h后，转到室温下至成熟。用生理盐水冲洗菌落以获得分生孢子。2000×g离心10min集菌，以生理盐水洗涤1次。以血细胞计数器将每一菌种浓度调至108细胞/mL,再离心后弃上清液，至1.5mL微量离心管中，－20℃备用。
图1部分真菌DNA在质量分数为0.8％琼脂糖凝胶电泳结果
四、玻璃珠－盐析法提取DNA
加入300μL提取液[2％TritonX－100,1％SDS,100mmol/LNaCl,10mmol/LTris－Cl(pH8.0),1mmol/LEDTA]悬浮菌体,再加入300mg玻璃珠,在高速振荡器上振荡,酵母菌为5min,曲霉和青霉为30min。200μL预冷饱和NaCl(约为6mol/L)，用力振荡15s，再以2500r/min离心15min。取上清液转移到另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇上下颠倒，离心10min，弃上清液后干燥。最后，加入100μL10mmol/LTris(pH8.0),1mmol/LEDTA和1μLRNase(SABC),37℃孵育1h。－20℃保存。
五、酶解－酚氯仿抽提法提取DNA
加入100μL山梨醇溶液[0.9mol/L山梨醇，0.1mol/LTris(pH7.6),0.1mmol/LEDTA]悬浮菌体，再加入50μL0.3mg/mL的溶细胞酶(以山梨醇溶液配制)和50μL0.28mol/L2－巯基乙醇,混合后37℃孵育3h。再加入裂解缓冲液50μL[0.05mol/LEDTA(pH8.0),0.3％SDS]65℃孵育30min，酚/氯仿/异戊醇抽提直到界面不再有白色物质。取上清液转移到另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇上下颠倒，离心10min，弃上清液后干燥。最后，加入100μL10mmol/LTris(pH8.0),1mmol/LEDTA和1μLRNase(SABC),37℃孵育1h。－20℃保存。
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