7.蛋白浓度的测定采用考马斯亮蓝法和福林酚法[2]。
8.酶蛋白活性测定：采用体外模拟部分糖代谢反应链[3]。大体过程为烯醇化酶催化2－磷酸甘油酸形成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸脱磷酸根为丙酮酸，在乳酸脱氢酶的作用下成为乳酸，同时伴有NADH＋变为NAD和H＋。以酿酒酵母烯醇化酶为标准(Us=227U/mg,pH=7.4，温度30℃)，用波长为340nm的分光光度计测定反应过程中单位时间内NADH转变为NAD的量，从而确定白念珠菌烯醇化酶的活性(Ua)。反应混合物为50mmol/LTris－HCl(pH为7.4)，5mmol/LMgCl2,2mmol/LEDTA,2mmol/LNADH,1.0mmol/LADP,10U丙酮酸激酶，10U乳酶脱氢酶及不同种烯醇化酶。反应总体积为1mL，反应温度为30℃。
二、结果
经数步分离纯化去杂蛋白，得相对分子质量为47000的单一蛋白。纯化过程每一步的蛋白得率见表1。酶活性测定可得反应时间(t)－NADH变化曲线，量出初始NADH及t的变化量即ΔNADH和Δt，根据公式：Ua=(ΔNADHaΔts/ΔNADHsΔta)×Us计算出Ua为2950.0U/mg。
三、讨论
以前测定深部念珠菌感染患者血清中的抗体多采用白念珠菌的粗制抗原，这种方法的特异性较低，烯醇化酶抗原仅在白念珠菌感染过程中被释放出细胞，而且抗原性强，所以测定相应抗体可以大幅度提高诊断的准确性。Mitsutake等[4]比较了检测烯醇化酶抗原、甘露糖抗原、Cand－Tec抗原和1，3－β－D葡聚糖4种诊断念珠菌深部感染的方法，在39例血培养阳性患者中，28例可检测出烯醇化酶抗原，在20例健康者的标本中均未检测出抗原，敏感性和特异性分别为71.8％和100％。我们运用ConA－Sepharose－4B除去糖蛋白和在碱性条件下(pH7.8或8.3)用DEAE－SephadexA－50除去阴离子蛋白，并通过Sephadex的分子筛作用分离出单一的蛋白酶，其具有很高的活性，约比酿酒酵母烯醇化酶的活性高出10倍左右。
参考文献
［1］金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社,1998.874－889.
［2］袁玉荪.生物化学实验.北京：高等教育出版社，1992.69－70.
