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MTT微量稀释法检测头癣分离株对抗真菌药的MIC值

  来源:120online      日期:2007-05-07
中华皮肤科杂志2000年第5期第33卷短篇论著作者:于长平 张福仁 赵毅 程焕明单位:250022济南,山东省皮肤病性病防治研究所...

  为探索敏感而可靠的丝状真菌药敏试验方法,我们用MTT微量肉汤稀释法测定了38株皮肤癣菌头癣分离株对特比萘芬和伊曲康唑的MIC值。

  一、材料与方法

  (一)实验材料:

  1.受试菌种:犬小孢子菌(M.canis)17株,须癣毛癣菌(T.mentagrophyte)15株,红色毛癣菌(T.rubrum)4株,紫色毛癣菌(T.violaceum)2株。皆分离自头癣患者,纯化后做小培养,根据菌落和显微镜下特征、玉米粉吐温琼脂试验、尿素酶试验等鉴定菌种,置4℃冰箱保存备用。

  2.药物:特比萘芬原粉由齐鲁制药厂药物研究所提供,批号98-05-10。伊曲康唑原粉来自西安杨森制药有限公司,生产日期98-09-10。

  3.培养基:沙堡培养基、玉米粉培养基和马铃薯培养基(PDA)按文献配制。新鲜配制RPMI1640培养基(Sigma公司),缓冲液用3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS,34.54g/L,Sigma公司),1NNaOH调pH至7.0,然后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。

  4.显色剂:MTT(上海伯奥生物科技公司),配成0.5%溶液。

  5.甲溶解液:十二烷基硫酸钠(SDS,AmreCo进口分装),二甲基甲酰胺(DMF,如皋市化学试剂厂),配成200g/LSDS-50%(V/V)DMF的甲溶解液。

  (二)试验方法:

  1.微量药敏板制备:将2种药物分别溶于100%二甲基亚砜,使质量浓度为0.4mg/mL,再用1640培养基稀释,然后10级倍比稀释,使起始浓度2μg/mL,终末浓度为0.0039μg/mL,对应加入无菌96孔酶标板中,每孔100μL,第11孔加不含药的1640液基100μL,第12孔加不含药液基200μL,第11孔作阳性对照、第12孔作空白对照。置-70℃冰箱备用。

  2.菌液制备:将受试菌株从4℃取出,活化后转种于PDA培养基,26℃培养10d,用含0.05%吐温80的无菌生理盐水1mL注入到PDA斜面上,收集菌悬液,用1640液基调整浓度到(2~4)×104cfu/mL,置4℃备用。

  3.菌液接种:药敏板从-70℃取出融化,将各菌株的菌悬液每孔加100μL,12孔不加,此步骤使菌液浓度稀释为(1~2)×104cfu/mL,药物质量浓度为0.002~1μg/mL。

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