1.3 新鲜PBMCs制备：取清晨空腹静脉血5 ml，预先加入2% EDTA抗凝，采用Ficoll密度离心法制备PBMCs，以经0.1%焦碳酸二乙酯(EDPC)处理后的PBS洗涤3次后悬浮于PBS调制成细胞悬液1×106/ml，用于PBMCs总RNA的提取。
1.4 RNA的提取与纯化：采用异硫氰酸胍一步法提取和纯化PBMCs总RNA［5］，用紫外分光光度计(日本岛津UV2200)测定各例总RNA量，吸光度260/280 nm比值在1.782～1.898，取3 μl总RNA用1.1%琼脂糖变性凝胶电泳带28 s与18 s之比约为2∶1来鉴定所提取RNA的完整性。
1.5 RT-PCR：利用逆转录试剂盒(Promega)严格按说明书操作，以Oligo(dT)15为引物合成cDNA，以不加入逆转录酶为阴性对照。再以上述各对引物在DNA合成仪(USA)上进行PCR扩增(PCR试剂盒，上海华美公司)，反应条件及循环次数参照文献［4］，反应总体积为50 μl，90 ℃热启动7 min后，以94 ℃变性60 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s进行循环，最后延伸7 min，产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳。
1.6 半定量分析：取10 μl反应产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳后，凝胶浸入0.5 μg/ml的溴化乙锭水溶液染色10 min，紫外灯下观察结果并照相，负片用图像分析仪对目的条带进行密度扫描，分别计算IL-6/β-actin、gp80/β-actin和gp130/β-actin的密度相对值，以代表mRNA的相对表达水平。
1.7 统计学处理：计数资料采用确切概率法进行检验；计量资料以
±s表示，采用配对t检验与直线相关分析对实验数据进行处理。
2 结果
2.1 LN患者及正常人外周血单个核细胞IL-6、gp80和gp130的mRNA检出阳性率。表1示，18例活动期LN患者PBMCs中可见明显的IL-6 mRNA表达有13例，而16例PBMCs中只有6例可见明显的IL-6 mRNA表达，正常对照组10名只有1名可见明显的IL-6 mRNA表达，余者几乎未见IL-6 mRNA表达条带。确切概率法分析，结果活动期LN患者PBMCs IL-6 mRNA的检出阳性率显著高于非活动期LN患者及正常人，后两者PBMCs IL-6 mRNA的检出阳性率差异则无显著性。类似的分析可得出，活动期LN患者、非活动期LN患者及正常人PBMCs gp80 mRNA与gp130 mRNA的检出阳性频率差异均无统计学意义。
上一页 1 [2] 3 4 5 6 7 下一页
