Therapeutic effect of interleukin-12 on murine infection with Mycobacterium tuberculosis through modulating Th1 and Th2 cytokine balance
ZHANG Tiantuo,KAWAKAMI Kazuyoshi,TANG Yingchun,et al.(Department of Internal Medicine,The 3rd Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510630,China)【Abstract】Objective To study the effect of IL-12 on cytokines of murine infection with Mycobacterium tuberculosis.Methods 42 BALB/c mice infected with Mycobacterium tuberculosis were randomized into normal control (PBS) and IL-12 (n=21) groups,treated with PBS or IL-12 respectively.Blood level of IFN-γ,IL-4,and IL-10 were detected with ELISA method.The numbers of viable bacteria in organs were counted.Survival rate after treatment was investigated.Results In IL-12 group,none was dead.The numbers of viable bacteria in lung,liver and spleen were (227±107)×105 cfu/ml,(4±3)×105 cfu/ml and (1.5±0.5)×105 cfu/ml respectively.INF-γ (1090±406) pg/ml.In PBS group,8 mice were dead.The numbers of viable bacteria in lung,liver and spleen were (659±405)×105 cfu/ml,(23±19)×105 cfu/ml and (10.8±3.5)×105 cfu/ml respectively.IFN-γ (548±214) pg/ml.There was significant difference between those two groups.No change of the level of IL-4 in two groups.Conclusions IL-12 induced IFN-γ production,promoted development of Th1 cell responses,modulated Th1 and Th2 cytokine balance，suggesting that IL-12 enhance the host defense against the infection.【Key words】Mycobacterium tuberculosis；Interleukin-12；Adjuvant,immunologic；Treatment outcome结核分支杆菌引起的感染和死亡,随着抗结核药物的开发和应用曾一度得到有效的控制,但从80年代以来,结核病出现疫情回潮现象。其主要原因是耐多药结核病(MDR-TB)流行、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、器官移植、免疫抑制剂使用等所致免疫损害宿主(ICH)增多和高龄人口中机体免疫力低下等因素,使结核分支杆菌感染难于控制,发展成为难治性倾向。因此针对提高机体免疫力,探讨使用生物免疫治疗已在研究和应用［1］。我们观察了白细胞介素12(IL-12)对结核分支杆菌感染小鼠的治疗效果和三种细胞因子水平的变化,现将结果报告如下。
材料与方法一、材料1.动物:取7～8周龄雌性SPF BALB/c小鼠42只,体重22～25 g,随机分成IL-12组和对照组各21只。2.结核分支杆菌的准备：取结核分支杆菌标准株H37Rv经Middlebrook 7H9液体培养基37℃震荡培养增菌生长10 d后,予生理盐水冼涤3次,按McFarland法配制成1×107 cfu/ml备用。3.动物模型：小鼠经戊巴比妥钠(70 mg/kg)麻醉,于眼窝静脉丛注入备用结核分支杆菌菌液50 μl,制成结核分支杆菌感染动物模型。4.重组小鼠白细胞介素12(rmIL-12)由Hoffman-La Roche公司赠送,IL-12按每只0.2 μg(200 μl量),对照组用磷酸盐缓冲液(PBS,含0.1%小鼠血清蛋白)200 μl/只,于细菌接种后即日起连续腹腔内注射7 d。二、方法1.分别于感染后的第2周、第4周杀死动物各6只,留取血清待检,取肺、肝、脾全份脏器,经组织匀浆机13 000 r/min,30 s制成匀浆,系列对倍稀释后接种于Middlebrook 7H11平板培养基上,37℃培养，14 d后作菌落计数。2.观察余下9只感染小鼠存活状态,以60 d为限计算生存率。3.血清标本分别作γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素 10(IL-10)测定。采用酶联免疫吸附(ELISA)夹心法检测,试剂盒购自美国Endogen公司,按说明书要求操作,酶标仪(Bio-Rad 2550型)450 nm测吸光度,建立标准曲线,求其含量。4.统计学处理:检测数据以
±s表示,采用t检验处理试验结果,比较各组资料差异的显著性,生存分析用Kaplan-Meier曲线,两组小鼠的生存曲线比较应用log-rank检验。
结果一、小鼠生存状况两组小鼠在结核分支杆菌感染后60 d内作生存率观察,PBS组从感染后第24 d开始陆续死亡,至观察期结束有2只存活,IL-12组无一死亡,生存曲线见图1,两组生存率比较存在显著性差异(P＜0.005)。
图1 IL-12和PBS两组小鼠生存曲线二、重要脏器菌落数在细菌感染后第2周、第4周时各取6只小鼠的肺、肝、脾全份脏器制成匀浆,系列稀释后作菌落计数,结果见表1。经统计学分析,第2周时脾组织的菌落计数已显示两组动物差异具有显著性(P＜0.001)。在第4周时肺、肝、脾组织的菌落计数两组动物差异均具有显著性(P分别＜0.05、＜0.05和＜0.001)。
表1 两组小鼠脏器菌落计数结果(×105cfu/ml,±s)
| 组别 | 只数 | 第2周 | 第4周 | ||||
| 肺 | 肝 | 脾 | 肺 | 肝 | 脾 | ||
| IL-12 | 6 |
3±3 |
0.5±0.3 |
0.40±0.10** |
227±107* |
4±3* |
1.5±0.5** |
| PBS | 6 | 5±6 | 0.9±0.5 | 1.30±0.30 | 659±405 | 23±19 | 10.8±3.5 |
注:与PBS组比较*P＜0.05，**P＜0.001
表2 两组小鼠血清细胞因子水平测定(pg/ml,±s)
| 组别 | 只数 | 第2周 | 第4周 | ||||
| IFN-γ | IL-4 | IL-10 | IFN-γ | IL-4 | IL-10 | ||
| IL-12 | 6 |
430±131* |
115±11 |
12±18** |
1 090±406* |
166±91 |
27±25 |
| PBS | 6 | 273±81 | 152±110 | 73±36 | 548±214 | 181±115 | 33±25 |
注:与PBS组比较*P＜0.05，**P＜0.01 三、血清IFN-γ,IL-4,IL-10水平测定杀死小鼠取脏器行菌落计数的同时,留存血清作IFN-γ、IL-4、IL-10水平检测,结果见表2。IL-12组中IFN-γ水平明显升高,与PBS组比较差异有显著性(P＜0.05)。IL-10水平在IL-12组早期降低,与PBS组比较差异有显著性(P＜0.01)。而IL-4水平变化较少,两组比较差异无显著性(P＞0.05)。
讨论IL-12具有多种生物学活性,其作用包括诱导静止和激活的T淋巴细胞和NK细胞产生IFN-γ,增强细胞毒活性,促进CD＋ 4和CD+ 8细胞的增殖和诱导Th1细胞特异性免疫应答等效应。以IL-12作为生物反应调变剂(BRM)用于抗感染免疫治疗已引起广泛的重视。IL-12是Th1细胞分化的必需因子。由于能增强细胞免疫功能,所以对真菌、原虫、弓形虫感染均有控制作用［2,3］。IL-12亦能影响结核分支杆菌感染小鼠的化学趋化因子反应,结核分支杆菌感染的刺激能增加内源性IL-12的产生,并与结核的活动性相关［4,5］。因此,IL-12与结核分支杆菌感染的关系仍有许多有待解决的问题。在本组研究中,我们选用对结核分支杆菌易感性高的BALB/c小鼠,采用腹腔内注射方式,给予外源性IL-12。结果表明:在血清中IFN-γ产生量明显增多,肝、脾、肺组织中的结核分支杆菌数明显减少,动物生存时间明显延长,提示IL-12的使用对结核分支杆菌感染小鼠起到显著的保护作用。分析实验结果,我们认为IL-12对Th细胞的调节,诱导Th0向Th1细胞分化,引发Th1/Th2漂移是免疫应答控制结核分支杆菌扩散的重要因素。BALB/c小鼠体内表现为Th2型反应,IL-4、IL-10表达量明显增高,而IL-12表达量明显减少,易感的BALB/c小鼠不能控制血源性结核分支杆菌感染而引起致命性的内脏扩散。在使用IL-12之后,通过刺激Th1细胞和NK细胞产生IFN-γ选择了Th1细胞亚群为主的应答,并正反馈地加强自身优势,影响了Th1/Th2两细胞亚群之间的平衡。在IFN-γ依赖条件下,可防止有害的Th2细胞反应及促进保护性Th1细胞反应。在BALB/c小鼠中,无论IL-12组或PBS组血清中IL-4水平的改变均不明显,提示促进Th1细胞反应的增强并非由抑制Th2细胞反应的减弱所致,相近结果Kobayashi等［6］亦有报道。IL-12对Th1细胞反应的促进是通过IFN-γ的产生而实现的,IFN-γ对单核巨噬细胞产生IL-12的能力又呈正反馈机制,IFN-γ在增强IL-12的作用中,部分是通过阻断巨噬细胞产生内源性IL-10实现的,这可以解释在本组研究中IL-12组IL-10水平为什么会降低。从结核病患者采取的外周血单核细胞中可发现有Th1细胞反应受抑,IFN-γ和IL-2的mRNA表达减少,有效的抗结核治疗能可逆性地促进Th1细胞反应的恢复［7］。在本组实验中外源性IL-12能显著减少各组织器官的结核分支杆菌数量,虽然IL-12本身在体外不能抑制细菌生长(数据没有显示),但作为一个起始因子,促进Th1细胞分化,启动增强细胞免疫过程,诱导产生的IFN-γ以及粒细胞-单核细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α均激活巨噬细胞抑制或杀灭结核分支杆菌［8］。因此,人为改变或恢复Th1/Th2细胞的平衡将为包括结核病在内的一大类疾病的免疫治疗开拓新的途径。综上所述,我们认为IL-12是一个有效的增强宿主抵御结核分支杆菌感染的免疫调节细胞因子。作为化疗的辅助治疗手段,尤其适应细胞免疫功能低下宿主合并结核分支杆菌感染的状态,对抗结核新菌苗的研制具有指导意义。但是,IL-12的治疗时机、最佳剂量、毒副作用和合并使用抗结核药物的相互关系值得更进一步的研究探讨。基金项目：卫生部基金资助项目(98-1-088)；广东省卫生基金资助项目(1998190)
参考文献1，王巍,金关甫,叶一秀,等.母牛分支杆菌菌苗治疗肺结核的临床研究.中华结核和呼吸杂志,1999,22:108-110.2，Kawakami K,Tohyama M,Xie Q,et al.IL-12 protects mice against pulmonary and disseminated infection caused by Cryptococcus neoformans.Clin Exp Immunol,1996,104:208-214.3，Gazzinelli RT,Wysocka M,Hayashi S,et al.Parasite-induced IL-12 stimulates early IFN-γ synthesis and resistance during acute infection with Toxoplasma gondii.J Immunol，1994,153:2533-2543.4，Rhoades ER,Coopper AM,Orme IM,et al.Chemokine response in mice infected with Mycobacterium tuberculosis.Infect Immun,1995,63:3871-3877.5，Munk ME,Mayer P,Anding P,et al.Increased numbers of interleukin-12 producing cells in human tuberculosis.Infect Immun,1996,64:1078-1080.6，Kobayashi K,Nakata N ,Kai M,et al.Decreased expression of cytokines that induce type 1 helper T cell/interferon-γ responses in genetically susceptible mice infected with Mycobacterium avium.Clin Immunol Immunopathol,1997,85:112-116.7，Zhang M,Lin Y,Iyer DV,et al.T-cell cytokine responses in human infection with Mycobacterium tuberculosis.Infect Immun,1995,63:3231-3234.8 Trinchieri G.Interleukin-12:a proinflammatory cytokine with immunoregulatory functions that bridge innate resistance and antigen-specific adaptive immunity.Annu Rev Immunol，1995,13:251-276.
(收稿日期：2000-01-18)
