对象与方法
一、研究对象
选择门诊或住院哮喘缓解期患者58例，男41例，女17例，年龄4～56岁,全部符合中华医学会1997年支气管哮喘防治指南诊断标准［3］，均为典型或确诊的病例，并根据临床特点和所需药物情况将患者分为间歇发作（0例）、轻度（26例）、中度（19例）和重度（13例）。健康成年人89名,男66名，女23名，年龄18～53岁，作为正常对照组。所有观察对象均为北方汉族。
二、引物合成
检测16位点精氨酸等位基因引物序列：上游 5′-CTT,CTT,GCT,GGC,ACC,CAA,TA-3′；下游 5′-ACA,ATC,CAC,ACC,ATC,AGA,AT-3′；16位点甘氨酸等位基因引物序列：上游 5′-CTT,CTT,GCT,GGC,ACC,CAA,TG-3′；下游 5′-ACA,ATC,CAC,ACC,ATC,AGA,AT-3′；聚合酶链反应（PCR）产物475 bp；27位点谷氨酰胺等位基因引物序列：上游5′-GGA,CCA,CGA,CGT,CAC,GCA,GC-3′；下游 5′-ACA,ATC,CAC,ACC,ATC,AGA,AT-3′；27位点谷氨酸等位基因引物序列：上游5′-GGA,CCA,CGA,CGT,CAC,GCA,GC-3′；下游 5′-下游 ACA,ATC,CAC,ACC,ATC,AGA,AT -3′；PCR产物442 bp；164位点苏氨酸等位基因引物序列：上游5′- TGG,ATT,GTG,TCA,GGC,CTT,AT-3′；下游 5′-CAC,AGC,AGT,TTA,TTT,TCT,TT-3′； 164位点异亮氨酸等位基因引物序列：上游5′- TGG,ATT,GTG,TCA,GGC,CTT,AT-3′；下游 5′-CAC,AGC,AGT,TTA,TTT,TCT,TT-3′；PCR产物662 bp。以上引物均由中国科学院微生物研究所基因工程中心Beckman Oligo DNA合成仪合成。
三、主要试剂和设备
脱氧核苷三磷酸（dNTP）为美国Promega公司产品。Taq DNA 聚合酶为美国Promega公司产品。饱和酚，蛋白酶K等均购自北京原平生物技术公司。PCR扩增仪为美国Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400产品；紫外分光光度仪为日本岛津Shimazu UV-600；Biofuge 22R型高速冷冻台式离心机为德国Heraeus公司产品。
四、实验方法
1.外周血DNA提取：取已二胺四乙酸(EDTA)抗凝的空腹静脉血5 ml,-20℃冻藏保存,采用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA。取10 μl溶解液分别于260 nm和280 nm波长测A值(曾称光密度OD),计算含量和纯度。
上一页 1 [2] 3 4 5 6 7 8 9 下一页
