(2)XhoI酶谱法:取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U,37℃1h后,置3%琼脂糖凝胶中,70V电泳15~20min,可产生46bp片段带(引物后面);与正常PCR产物比较,XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。
(3)Southern印迹法:PCR产物20μl经电泳分离后,用变性液处理60min,再用中和液处理90 min,转移至硝酸纤维素膜上:80℃烤膜2 h,42℃预杂交(杂交液中)30 min, 加入32p标记HSVP3探针后,42℃杂交过夜;次日用1%SDS/ PBS pH7.2, 42℃洗15min, 0.5% SDS/PBS pH7.2, 42℃洗15min; 膜置X线暗盒内放射性自显影12~15h, 显影为阳性, 不显影为阴性。
(二)套式PCR
套式PCR(nested primers-polymerase chain reaction,NP-PCR)是通过“外侧”、“内侧”两对引物,即一对扩增较大DNA片段的“外侧”引物和一对位于扩增产物中再扩增小片段的“内侧”引物,这样两次连续放大可以提高PCR检测的灵敏度,保证产物的特异性。但该方法不能分型,能100%检出HSV-1,50%检出HSV-2,应改进分型检测HSV,更好地在临床应用和基础研究中推广应用。
1、标本处理:
(1)标本采集同上
(2)DNA 制备:①脑脊液:取100μlCSF 水煮15min,加入250μl无水乙醇,放-30℃10 min;离心10000g30 min,去上清,30℃干燥后,加入10μl DW; ②脑组织细胞:取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液,56℃作用1h,水煮10 min;取上清加入等体积酚一氯仿(V/V),轻摇10 min,离心10000r/ min×10 min;取水相,加入250μl DW溶解。
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