2、PCR扩增
(1)引物设计:选择HSV1糖蛋白D基因为检测靶基因。
NP-PCR 的引物和探针序列
“外”引物
BJHSV1.1
ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA
19-43
BJHGV1.2
CATACCGGAACGCACCACACAA
218-239
“内引物”
BJHSV1.3
CCATACCGACCACACCGACGA
51-79
BJHSV1.4
CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA
166-188
探针
BJHSV-1PRO
TACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT
96-125
(2) PCR实验体系和程序: 反应体积为50μl;模板10μl;BJHSV1.1 0.5μl(0.2pmol/L); BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L); 10×缓冲液5μl; 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L);DW 27μl; 石蜡油30μl。循环参数为95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循环20次, 取其扩增产物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反应体系中进行套式扩增, 先95℃变性2min,循环参数为95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循环30次后,72℃延伸5 min;。
(3) 扩增产物分析:
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