① 琼脂糖凝胶电泳染色法:
取扩增产物10μl点样于2%琼脂糖凝胶中, 70V电泳15-20min,溴化乙锭染色5min,于紫外灯下观察结果,在溴酚兰后面有一条,或二条亮红条带为阳性结果, HSV-2带在前,HSV-1带在后,无带则为阴性结果。
② Southern印迹法:
PCR产物20μl 经电泳分离后,用变性液处理60min,再用中和液处理90min,转移至硝酸纤维素膜上,80℃烤膜2h,42℃预杂交(杂交液中)30min,加入32P标记HSV探针后,42℃杂交过夜,次日用1%SDS/PBS pH7。2,42℃洗15min,0.5%SDS/PBS pH7.2,42℃洗15min;膜置X线暗盒内,放射性自显影12-15h,,显影为阳性,不显影为阴性。
(三)、聚合酶链反应—酶谱法(polymerase chain reaction-endonuclease cleavage PCR-EC)
具有经济广泛等特点;不仅能一次性分型检测HSV-1,HSV-2,EBV,CMV四种病毒,而且方法本身快速、方便、无放射线损伤,易被实验室接受。可检出3个CFU的HSV1,灵敏度高,能检测出中枢神经系统感染第1dCSF中HSV DNA阳性结果,并可用于药物治疗效果的评价。由于病毒的变异性,会出现酶切点突变丢失现象,从而造成酶切阴性结果。对此可以通过型特异性探针或序列分析解决。
1. 标本处理
(1)标本采集,方法同上。
(2)DNA模板制备:每份标本取200μl,按200μg/ml加入蛋白酶k,56℃作用1h;
加入等体积的酚—氯仿(v/v)轻摇10min,离心1000r/min×5min;取水相加入500μl(2.5倍体积)无水乙醇,-20℃过夜沉淀DNA,离心15000r/min×5min,吸去液体,30℃干燥后,加蒸馏水25μl溶解, 待检。
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